Sondeando las conexiones a escala fina en el cerebro

El rastreo de conexiones, como las de esta sección del cerebro de la mosca de la fruta, podría descubrir los vínculos entre la arquitectura neuronal, la biología y las enfermedades. Crédito: FlyEM en HHMI/Google Research

POR ESTHER LANDHUIS

Fuente: Nature / 19/10/2020

Fotografía: FlyEM en HHMI/Google Research

La inteligencia artificial y la mejora de la microscopía hacen factible el mapeo del sistema nervioso con una resolución cada vez mayor.

Hay 70 millones de neuronas en el cerebro del ratón, y Moritz Helmstaedter quiere mapearlas todas. Era estudiante de medicina en la Universidad de Heidelberg en Alemania cuando los psiquiatras de allí sugirieron que algunos aspectos de la psique humana carecían de una explicación biológica. "Me quedé totalmente consternado", recuerda Helmstaedter, que ahora es director del Instituto Max Planck de Investigación Cerebral en Frankfurt, Alemania.

Aunque el cerebro sigue siendo un misterio, Helmstaedter estaba convencido de que lo que ocurre allí "debe ser un fenómeno mecánico al final, por muy complejo que sea". Ha dedicado las dos últimas décadas a trabajar esos mecanismos - y él y otros neurocientíficos están finalmente empezando a rascar la superficie, un micrómetro cúbico a la vez.

A partir de la década de 1970, se necesitó más de una década para desentrañar el circuito neural del gusano de un milímetro, Caenorhabditis elegans. Al investigar la relación entre los genes y el comportamiento, el biólogo Sydney Brenner y sus colegas del Laboratorio de Biología Molecular del MRC en Cambridge, Reino Unido, trazaron laboriosamente las finas ramas y conexiones sinápticas de cada célula nerviosa, codificándolas por colores a mano en miles de impresiones de micrografías electrónicas. Ese mapa de cableado - el primer y único conjunto completo de conexiones sinápticas en el sistema nervioso de un animal - fue almacenado en una computadora del tamaño de una habitación y publicado (1) como el primer "connectome" completo de un animal en una obra de 340 páginas en 1986.

Caenorhabditis elegans tiene menos de 400 neuronas; los cerebros humanos tienen 86.000 millones. Así que, por ahora, los científicos están mirando un hito intermedio: el mapeo de los circuitos neuronales a escala fina del ratón (2).

Incluso con unas 1.000 veces menos células, el cerebro del ratón plantea un desafío formidable, dice Jeff Lichtman, un neurocientífico de la Universidad de Harvard en Cambridge, Massachusetts, que es uno de los líderes de un consorcio mundial que tiene como objetivo reconstruir el cableado neural del cerebro de un ratón en la próxima década. "Estamos tratando con un conjunto de datos que estará a la escala de un exabyte". Un exabyte es un billón de gigabytes; todo el genoma humano puede ser representado en alrededor de 1,5 gigabytes. En términos de tamaño de los datos, el mapeo del conector del cerebro del ratón será "enorme comparado con cualquier cosa que se haya hecho como un proyecto único", dice. "Los conectomas son simplemente magníficamente complicados".

Sin embargo, la tecnología para hacer posible tal empresa está casi lista. Con los avances en la microscopía y la inteligencia artificial (IA), y la ayuda de los jugadores humanos, los investigadores están comenzando a mapear las redes neuronales y sus conexiones a una resolución y escala cada vez más altas. En los últimos años, pequeños trozos de cerebro, incluyendo trozos de la retina y la corteza cerebral de los mamíferos, se han puesto en evidencia. Y en septiembre, los investigadores que trabajan en la mosca de la fruta Drosophila reportaron (3) la mayor reconstrucción hasta ahora: 25.000 neuronas en la hemibraina, un cubo de tejido de 250 micrómetros de lado que representa el 40% del cerebro de la mosca.

Estos no son meros ejercicios de la gran biología. A medida que la conectomía empuja los límites tecnológicos y computacionales, los investigadores esperan aprovechar estos conjuntos de datos para aprender cómo se almacenan las experiencias en el cerebro, con potenciales conocimientos sobre el autismo, la esquizofrenia y otras "conectopatías".

Desarrollos tempranos

Después de que el diagrama de cableado neuronal de C. elegans lanzara la conectomía en 1986, el campo se silenció, dice Helmstaedter. Fue una cuestión de tecnología: los investigadores no tenían forma, más allá de lo que el equipo de Brenner había hecho, de sondear los circuitos neurales a escalas de conectores.

Como estudiante de doctorado a principios de la década de 2000, Helmstaedter clavó electrodos en las células nerviosas para averiguar cuáles estaban conectadas eléctricamente, un enfoque que podría permitir el registro simultáneo de cuatro o cinco neuronas. Sin embargo, las redes tienen cientos o miles de células nerviosas y millones de conexiones. "Para mapear realmente los circuitos, necesitábamos algo más", dice.

Eso llegó en 2004. Winfried Denk, entonces en el Instituto Max Planck de Investigación Médica en Heidelberg, y sus colegas instalaron una herramienta de corte de precisión llamada microtomo en la cámara de vacío de un microscopio electrónico (EM), haciendo posible la automatización de imágenes a nanoescala. Esto revitalizó el campo (4).

Llamado microscopía electrónica de escaneo de bloque de cara en serie (SBEM), el método de Denk consiste en cargar un bloque de tejido en la máquina, que luego toma automáticamente imágenes de la cara expuesta, raspa la capa superior de tejido y repite, durante días o semanas a la vez. En 2013, el equipo de Denk, dirigido por Helmstaedter, un ex postdoctorado en el laboratorio, utilizó la SBEM para mapear un conjunto completo de conexiones sinápticas para 950 neuronas en la retina del ratón (5). Se trataba de una empresa importante: el costo, incluidos los equipos, los salarios y unos 300.000 euros (350.000 dólares de los EE.UU.) en concepto de honorarios pagados a los estudiantes universitarios para trazar los circuitos en los conjuntos de datos de la EM, ascendía a unos 2 millones de euros. Y reveló nuevos subtipos de células. Pero más allá de eso, el trabajo proporcionó un mapa completo para que los investigadores identificaran los socios de interacción para las células de interés, dice Helmstaedter - "como usar un mapa callejero para la navegación frente a la prueba y el error".

Matemáticas de gusanos

Los estudiantes que rastrearon esos circuitos neurales lo hicieron usando computadoras. Ese cambio comenzó a principios de la década de 2000, cuando los investigadores comenzaron a adoptar un enfoque computacional para mapear el conectoma. Esto no era aprendizaje automático; los humanos todavía hacían el trabajo. Pero en lugar de trazar las neuronas en papel con lápices de colores como lo hizo el equipo de Brenner, hicieron clic con el ratón a través de pilas de imágenes digitalizadas.

El biólogo Scott Emmons de la Facultad de Medicina Albert Einstein de la ciudad de Nueva York y su equipo, por ejemplo, digitalizaron las imágenes originales de Brenner y utilizaron un enfoque computacional para trazar un mapa de los circuitos que regulan los comportamientos de apareamiento en la cola de un macho C. elegans. (El esfuerzo de 1986 se centró en el otro sexo de C. elegans, el hermafrodita).

Conectoma del cerebro adulto de Caenorhabditis elegans. Crédito: D. Witvliet et al./bioRxiv

Emmons contrató entonces a un estadístico para que aplicara la teoría de grafos -una rama de las matemáticas utilizada para analizar redes como las rutas de autobuses o los mapas de propagación de enfermedades- para calcular la fuerza de las conexiones sinápticas y averiguar qué partes de la red de conectores impulsan comportamientos específicos. Aunque los matemáticos habían estudiado las redes neuronales artificiales durante décadas, el trabajo de C. elegans, del que se informó (6) en 2012, fue considerado el primer análisis cuantitativo de una red neuronal natural, dice Emmons.

Ampliando esos esfuerzos, en 2019 Emmons y sus colegas publicaron (7) conectores cuantitativos de los sistemas nerviosos completos de ambos sexos de C. elegans, que comprenden 687 neuronas. Uno de los objetivos era determinar cómo se diferenciaba la conectividad entre el macho y el hermafrodita. Pero distinguir las diferencias basadas en el sexo de la variabilidad biológica natural entre los individuos resultó ser un hueso duro de roer, retrasando el trabajo durante un año completo, y requiriendo aún más matemáticas. Al final, el equipo llegó a la conclusión de que hasta el 30% de las conexiones neuronales podrían reflejar verdaderas diferencias basadas en el sexo, dice Emmons, en contraposición a las disparidades derivadas de las condiciones de cría o los errores metodológicos.

Complejidad inesperada

Trazar los circuitos neurales a través del cerebro de un diminuto gusano requiere miles de secciones de 30-50-nanómetros. "Incluso si eres un dios, no puedes cortar 5.000 secciones sin estropear nada", dice Mei Zhen, un neurocientífico de la Universidad de Toronto en Canadá.

Ahora intenta hacerlo ocho veces. En un análisis descrito en una preimpresión de bioRxiv en mayo de 2008, los investigadores dirigidos por Zhen, Lichtman y el físico de Harvard Aravinthan Samuel reconstruyeron los conectores a través de ocho etapas de desarrollo, para aprender cómo el diagrama de cableado de C. elegans cambia a medida que el gusano madura de larva temprana a adulto. Seccionaron la mayoría de sus muestras con un ultramicrotomo recolector de cinta automatizado, desarrollado en el laboratorio de Lichtman, que recoge secciones en serie y las coloca en secuencia en un carrete para su posterior visualización en un microscopio electrónico de barrido (9). "Convierte un gusano en un rollo de cinta", dice Zhen.

Usándolo, el equipo detectó enormes diferencias en el cableado de los gusanos. Incluso entre animales genéticamente idénticos, dice Zhen, cerca del 43% de las conexiones no eran las mismas.

En el Laboratorio de Biología Molecular de MRC, la neurocientífica de sistemas Marta Zlatic estudia otra criatura parecida a un gusano: Las larvas de Drosophila. Con una longitud de 4 a 8 milímetros, las larvas son más grandes que la C. elegans pero tienen de 10 a 20 veces menos neuronas cerebrales que las moscas adultas. "Así que podemos reconstruir los circuitos mucho más rápido, y podemos hacerlo en muchos individuos", dice Zlatic, que combina la conectomía con otras técnicas para correlacionar la estructura neuronal con la función.

En un estudio (10) publicado en marzo, el equipo de Zlatic analizó 102 pares de neuronas involucradas en la evitación de olores. Encontraron que incluso en estos pequeños insectos, las redes celulares lejanas regulan el aprendizaje. "Cuando un animal aprende algo nuevo sobre un olor, qué tan rápido y qué tan bien aprende eso será influenciado por todo lo demás que haya aprendido sobre ese olor", dice.

Aprendizaje automático

La ampliación de esos análisis a animales como la Drosophila adulta o los ratones, que son capaces de un aprendizaje de orden superior, es mucho más difícil. Pero allí también se están haciendo progresos.

En un estudio de 2019 (11), Helmstaedter y sus colegas usaron el SBEM para visualizar y reconstruir una mota del cerebro de un ratón en una región que procesa la información sensorial. Midiendo 500.000 micrometros cúbicos, el volumen contenía unos 2,7 metros de cableado neuronal y 400.000 conexiones sinápticas. Contenía sólo 89 neuronas, pero era 300 veces más grande que las reconstrucciones anteriores de la corteza cerebral de los mamíferos.

La reconstrucción de estos circuitos con las técnicas estándar de entonces - mover de rebanada en rebanada, trazando manualmente cada célula nerviosa - habría llevado cientos de miles de horas, estima Helmstaedter. Así que su equipo combinó algoritmos de procesamiento de imágenes automatizados con enfoques de IA de aprendizaje automático, y centró el esfuerzo humano en marcar las ramas de las neuronas mientras dejaba que los ordenadores se encargaran de la reconstrucción volumétrica. Esto redujo la carga de trabajo a 20.000 horas, lo que equivale a 10 personas trabajando a tiempo completo durante un año. Otras mejoras de la IA aceleraron aún más el proceso, entrenando a los ordenadores para evaluar las reconstrucciones montadas por la máquina y solicitando ayuda humana sólo cuando era necesario.

Mientras tanto, los investigadores del Campus de Investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes (HHMI) en Ashburn, Virginia, pusieron sus ojos en la Drosophila. El cerebro de una mosca de la fruta tiene muchas menos neuronas que el cerebro de un ratón, pero sus cables son más delgados y más densos, dice Shan Xu, un físico aplicado de Janelia. Trazar estas conexiones hasta su finalización requeriría una resolución de 8 nm - 3-6 veces lo que fue posible con el escaneo EM cuando Xu se unió al HHMI en 2009. Dada la tecnología disponible en ese entonces, dice, las imágenes por sí solas habrían tomado una década.

Y ese no fue ni siquiera el mayor desafío. Para rastrear cada proceso neuronal a esta resolución, las imágenes tenían que ser perfectas; una brecha de 100 nm podría hacer que el conjunto de datos fuera inútil. "Uno querría operar una máquina durante una década sin errores", dice Xu.

Xu pasó varios años investigando minuciosamente los modos de fallo y las condiciones que los desencadenaron. "Antes de que falle, ¿cuáles son los signos reveladores? ¿Cuáles son los indicadores que puedo capturar y detener inmediatamente la operación? Y entonces, ¿cómo puedo reiniciar desde allí sin problemas?" preguntó. En lugar de la perfección, optó por la inteligencia, construyendo un sistema que pudiera apagarse a sí mismo cuando se produjera un fallo en el ordenador, un fallo en la bomba de vacío u otro tipo de mal funcionamiento. Ese cambio de mentalidad "cambió completamente la imagen", dice Xu. Ayudó a su equipo a perfeccionar otra tecnología de cara al bloque, el FIB-SEM, que corta usando un haz de iones enfocados en lugar de un microtomo y produce imágenes de mayor resolución con pocos defectos (12).

Xu y sus colegas ejecutaron dos de estos sistemas FIB-SEM en paralelo durante unos dos años. Luego, después de que una computadora alineó las pilas de imágenes EM, un equipo de 50 empleados del HHMI trabajó a tiempo completo durante un año para corregirlas. Al analizar miles de imágenes por día, los correctores aprendieron rápidamente a detectar errores, por ejemplo, segmentos mal unidos o piezas huérfanas que necesitaban ser conectadas. "Uno desarrolla su ojo para el tipo de neurona que está mirando", dice Erika Neace, una desarrolladora analítica y veterana correctora de pruebas de Janelia. En total, el equipo rastreó 25.000 neuronas y sus 20 millones de conexiones en el hemibrain3.

Por otra parte, otro equipo de Janelia imaginó el cerebro de la mosca utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM), una tecnología más antigua que pasa electrones a través de especímenes delgados en lugar de escanear una superficie como lo hace el FIB-SEM. Equipando el microscopio con una serie de cámaras y componentes robóticos para procesar especímenes más grandes a mayores velocidades, imaginaron un cerebro de Drosophila adulto completo (13). A continuación, validaron el conjunto de datos resultante - los 106 terabytes - trazando meticulosamente los circuitos en el cuerpo del hongo, una estructura cerebral importante para el aprendizaje y la memoria.

Hoy en día, los investigadores están crowdsourcing el proceso de anotación, creando juegos en línea como bancos de pruebas para la conectomía a escala fina utilizando la IA y voluntarios humanos. En agosto, los investigadores dirigidos por los neurocientíficos Sebastian Seung y Mala Murthy de la Universidad de Princeton en Nueva Jersey lanzaron una plataforma similar a un juego llamada FlyWire, que presenta piezas identificadas por la IA de neuronas del conjunto de datos de cerebro volador de Janelia para que los jugadores las ensamblen (14). Basado en Eyewire -un juego anterior desarrollado por el laboratorio Seung utilizando un conjunto más pequeño de imágenes de laretina del ratón- FlyWire complementa la plataforma de visualización Neuroglancer de Google con herramientas que permiten a varios usuarios ver y editar neuronas del mismo conjunto de datos al mismo tiempo.

A diferencia de la reconstrucción de la hemibrina de Xu, que fue procesada por un equipo de corrección interno, FlyWire invita a todos a contribuir. Y esas contribuciones mejoran el sistema con el tiempo, dice Seung. Cuando un usuario edita una neurona haciendo clic en un botón para dividir o fusionar piezas, esa acción envía un mensaje que entrena a la máquina para detectar reconstrucciones erróneas y, con el tiempo, corregirlas. "Este es un momento realmente profundo, filosóficamente interesante", dice Lichtman. "Las máquinas están aprendiendo a ser más inteligentes estudiando el cableado de las máquinas que son fundamentalmente más inteligentes - máquinas biológicas."

Seung está colaborando ahora con investigadores del Baylor College of Medicine en Houston, Texas, y el Instituto Allen para la Ciencia del Cerebro en Seattle, Washington, para construir una nueva comunidad en línea, Pyr (como en, 'Pyr en el cerebro'), para mapear una pieza aún más grande del cerebro del ratón. En octubre, el equipo del Instituto Allen, dirigido por Clay Reid y Nuno da Costa, describió el método utilizado para recoger esos datos. Utilizando seis TEM de la era de 1980 retroadaptados con cámaras de gran campo de visión y un sistema personalizado de manejo de muestras de carrete a carrete, el equipo tomó imágenes de un milímetro cúbico de corteza visual de ratón en 6 meses, produciendo 2 petabytes de datos (15). Ahora el equipo está buscando escalar sus operaciones al nivel del cerebro completo, dice Wenjing Yin, un científico del Instituto Allen que ayudó a desarrollar la tubería de imágenes. "Hay muchas preguntas y problemas que tenemos que resolver", dice.

Con unos 70 millones de neuronas de ratón aún sin explorar, la comunidad de conectores tendrá su trabajo por delante. Pero Helmstaedter es optimista. "Es un momento extremadamente emocionante para trazar un nuevo territorio", dice, "con todas las sorpresas que esto siempre conlleva".

Nature 586, 631-633 (2020)

doi: https://doi.org/10.1038/d41586-020-02947-5